3种5’RACE技术的比较与优化

【摘要】   　　目的 研究 环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。 方法 以播娘蒿RNA为模板，先按 文献 标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果 未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论 SMART 5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。

【关键词】   5'RACE；比较；优化

    Abstract：Objective To study the characters of Cycling 5'RACE,TdT 5'RACE and SMART 5'RACE methods and optimize them.Methods Standard 5'RACE ways were done at first with RNA templet of Descurainia sophia. The n they were optimized with delaying the reaction time and increasing the concentrations of some reactants.Results Before optimized,the gel-straps in Cycling 5'RACE and TdT 5'RACE were invisible.The gel-strap in SMART 5'RACE could be found but not clear.After optimized,dispersed gel-straps appeared in Cycling 5'RACE,the result of TdT 5'RACE was better and still dispersed.The best was SMART 5'RACE, which got the clear and specific strap.Conclusion The result of SMART 5'RACE was best,TdT 5'RACE was better,and Cycling 5'RACE way was still under improving.With optimization,the specificity of the results could be obviously improved.It provided bases for choosing of 5'RACE methods in research.

    Key words:5'RACE;comparison;eptimization

     经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。近年来随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)为简洁方便的基因克隆 发展 道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3'端或5'端。5'RACE比3'RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA 5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增（最多进行三轮巢式扩增），增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5'RACE的特异性。本试验通过利用5'RACE技术获得播娘蒿CBF基因的5'端序列，对常用的环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法［1］及SMART反转录酶法［2,3］3种5'RACE方法进行比较和优化。

    1  试验材料

    1.1  模板

    播娘蒿在25℃下生长30 d后，将完整植株放置于4℃下冷驯化12 h后，取其叶片提取RNA。

    1.2  引物设计与合成

    根据已知播娘蒿CBF基因的EST序列，设计5'RACE反应所需引物。由于不同的原理，5'RACE有3种克隆扩增方法，因此根据不同的方法设计5'RACE引物DK 01、DK 04、DK 05、DK 06。此外合成RACE通用引物Oligo dT-3sites Adaptor Primer、3sites Adaptor Primer、5'-CDS Primer、SMART II oligo、UPM和NUP。引物合成及测序由上海博亚生物工程公司完成。

    2  试验方法

    2.1  环化法

    利用Takara公司的5'- Full RACE Core Set

    2.1.1  首链cDNA的合成  反转录体系如下：1.5μl 10×RT Butter，0.5 μl RNase Inhibitor，1 μl AMV Reverse Transcriptase XL，1 μl 5端磷酸标记反转录引物，5 μl总RNA，再加入RNase Free dH2O至总体积15 μl。反应条件为30℃反应10 min，50℃反应1 h，80℃反应2 min。

    2.1.2  RNA的分解  反应体系如下：15μl cDNA反应液，15 μl5×Hybrid RNA Degeneration Buffer，再加入d H2O至总体积75 μl。将上述反应液加入1μl RNase H，30℃反应1 h；再加入100 μl灭菌蒸馏水，500 μl无水乙醇混匀后-20℃沉降30 min；12000 r离心10 min后去上清，用500 μl 70%乙醇洗涤后干燥。

    2.1.3  通过连接反应将单链cDNA环化  向干燥的单链cDNA中加入8 μl的5×RNA(ssRNA)Ligation Buffer和12 μl的d H2O溶解，再加入20 μl的40%PEG#6000均匀混合，再加入1 μl T4 RNA Ligase，16℃反应24 h。

    2.1.4  PCR反应  将上述反应液作为模板，以DK09与DK05为引物，用Ex Taq酶PCR，体系与反应条件与2.3相同，反应中退火温度为60℃；

    将第一次PCR反应液稀释10倍后作为模板，以DK 04与DK 06为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应体系和条件如前，仅条件中的退火温度改为50℃。将第二次PCR产物电泳观察结果。

    2.2  末端脱氧核糖核酸转移酶法

    利用Takara公司的AMV Reverse Transcriptase

    2.2.1  首链cDNA的合成  将14 μl的RNA与0.5 μl的引物DK01和1 μl的RNase inhibitor混合均匀，70℃放置10min后冰浴1min，短暂离心；随后加入2.5 μl的10×RT Buffer，1.25 μl的dNTP Mixture（各10mmol/L）和2.25 μl的DTT(100 mmol/L)，加去RNase水至总体积24 μl，混匀后42℃放置1 min，再加入1 μl的AMV Reverse Transcriptase XL，55℃下反应2 h，再70℃处理15 min后，短暂离心。

    2.2.2  RNA的降解和cDNA的纯化  将前一步得到的25 μl cDNA和1 μl的RNase混合，37℃下放置30 min；随后加入80 μl无水乙醇沉降18h，12000 r离心10 min后去上清，加入100 μl的70%乙醇洗涤干燥，加入20 μl ddH2O溶解。

    2.2.3  cDNA末端加尾  反应体系如下：5 μl 5×TDT Buffer，15 μl cDNA，2.5 μl 0.1%BSA，0.5 μl dATP（100mmol/L），加入ddH2O至总体积24 μl。将上述反应液94℃处理2～3 min后冰浴1 min，加入1 μl TdT，37℃放置12 h，然后65℃处理10 min，冰上冷却后短暂离心。

    2.2.4  PCR反应  以上一步获得的反应液为模板，以DK01和Oligo dT-3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶PCR，反应中退火温度为50℃，扩增15个循环；将第一次PCR的反应液稀释10倍为模板，以DK09与3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应中退火温度为60℃，扩增30个循环。将第二次PCR产物电泳观察结果。

    2.3  SMART反转录酶法

    利用CLONTECH公司的SMART 5'RACE反转录酶PowerScriptTM Reverse Transcriptase特殊的反转录能力进行5末端的扩增。