土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定
【制药类毕业论文】【摘要】 目的 对土壤来源的Streptomyces sp.3423代谢产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化和结构鉴定。方法 采用MTT法，以对K562细胞的抑制活性为指标，筛选活性菌株。发酵培养液经各种色谱技术分离纯化，并通过对其理化性质、质谱、紫外、红外和核磁共振等图谱数据分析，确定化合物的结构。结果和结论 Streptomyces sp.3423代谢产物中分离得到6个已知化合物。生物学活性研究发现化合物3，4对K562细胞具有抑制活性，其中化合物4活性最强，IC50为14.1μg/ml。
【关键词】 土壤放线菌 环二肽 抗肿瘤活
本实验室建立了K562细胞和对格列卫耐药的K562细胞体外筛选模型［1］，通过筛选1000株土壤微生物发酵液，发现其中十余株放线菌的发酵液对K562细胞生长有强的抑制活性。选取其中一株放线菌3423，对其进行扩大发酵，并对代谢物进行提取、分离纯化、结构鉴定及活性研究。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
色谱包括分析型液相色谱仪(大连依利特公司)，Kromasil色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，配备UV230+型UVVIS检测器，制备型高效液相色谱仪(大连依利特公司)Spherisorb色谱柱(10mm×250mm，10μm)；核磁共振谱(Varian，Inova 600x型核磁共振仪)；质谱(Micromass Zabspec型质谱仪)；制备薄层(HSGF254烟台化工研究院)；反相硅胶ODS(J.BAKER)；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产；所用试剂为分析纯。
实验菌株是分离自我国江苏地区土壤的放线菌，分离保存方法见文献［1］，本实验选择菌株代号为3423。
1.2 发酵
首先将菌种涂布于平面培养基［成分(%)：可溶性淀粉1，葡萄糖2，牛肉膏0.1，酵母提取物0.4，NaCl0.2，K2HPO4 0.025，CaCO3 0.2，琼脂1，pH=7.2］上，30℃培养6d，挑取多个单克隆菌落接种于种子培养基(成分同平面培养基)上，30℃培养48h，显微镜下观察菌体形态，选择较好的一株作为菌种接种于发酵培养基(成分同种子培养基)，于摇瓶中振荡培养(250ml/500ml)，30℃培养72h。发酵终点pH为6.8左右。
1.3 提取
发酵液经离心得到菌丝体和上清液，菌丝体经丙酮浸泡12h、过滤、减压浓缩至无丙酮，乙酸乙酯提取三次；上清液加入AB8大孔吸附树脂，搅拌吸附8h，过滤，AB8用丙酮解吸附，减压浓缩至无丙酮，加等体积乙酸乙酯提取两次；合并菌丝体及发酵液的乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠干燥、过滤和减压浓缩至褐色浸膏(2g)。
1.4 分离与纯化
初提物(1.8g)采用C18反相色谱分离，以55%甲醇洗脱，收集流份以TLC分析结果进行合并，得到11个组分(A1～A11)。A1(119mg)再经过硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化(氯仿∶甲醇=40∶1)，得到化合物I；A4(414mg)经过硅胶柱层析分离，采用反相HPLC制备色谱纯化(60%甲醇)，得到化合物II；A7(193mg)经过制备HPLC得到化合物III(18mg)； A9经过制备薄层色谱和凝胶过滤得到化合物IV；A10(75.9mg)经过正相制备薄层层析(氯仿∶甲醇=100∶0.7)得到化合物V(8mg)和B10两个组分，B10再经过反相HPLC制备色谱纯化(55%甲醇)得到化合物VI(8.8mg)。
1.5 活性测定
将各化合物配制成不同浓度的溶液，加入K562细胞中。K562细胞系用含10%小牛血清PRMI1640培养液，37℃，通入5% CO2的培养箱中培育72h，加入20μl MTT溶液，继续孵育4h，吸去细胞悬液，加入120μl DMSO溶解沉淀物，酶标仪490nm下测定其光密度值。
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
化合物I 分子式C7H10O4，1HNMR(CDCl3)δH4.5(1H，dd，10.8Hz，6.6Hz)，4.3(1H，dd，13.8Hz，6Hz)，3.9(1H，dd，13.8Hz，10.8Hz)，3.7(3H，s)，2.1(3H，s)，数据与文献报道一致［2］，经鉴定为6甲基3羟基5甲氧基2.3二氢吡喃4酮。
化合物II 分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δH8.2(1H，s)，9.7(1H，s)，7.22(2H，d，7.2Hz)，7.2(2H，dd，8.2Hz，7.0Hz)，7.11(2H，d，8.2Hz)，5.25(1H，d，10.4Hz)，4.29(1H，dd，4.0Hz，4.9Hz)，3.11(1H，dd，4.0Hz，13.7Hz)，2.89(1H，dd，4.9，13.7)，2.6(1H，dqq，6.4Hz，10.4Hz)，0.83(3H，d，6.4Hz)，0.7(3H，d，6.4Hz)。数据与文献一致［3］，鉴定为3苄基6亚异丁基哌嗪2，5二酮。
化合物III 分子式C16H18N2O2，1HNMR(CDCl3)δH8.01(1H，s)，7.43(2H，t，7.2Hz，7.8Hz)，7.38(2H，d，7.8Hz)，7.33(1H，t，7.2Hz，7.8Hz)，6.98(1H，s)，5.48(1H，d，9.6Hz)，3.28(3H，s)，1.08(6H，d，6.6Hz)，以上数据与文献一致［4］，鉴定为6亚异丁基3苯亚甲基1N甲基哌嗪2，5二酮。
化合物IV 分子式C15H16N2O2，1HNMR(DMSO)δH10.34(1H，s)，9.96(1H，s)，7.50(2H，d，7.6Hz)，7.40(2H，d，7.6Hz)，7.31(1H，t，7.6Hz)，6.74(1H，S)，5.70(1H，d，10.4Hz)，2.97(1H，m，6.7Hz，10.4Hz)，0.97(6H，d，10.4Hz)。数据与相关文献对照［5］，确定化合物的结构为6亚异丁基3苯亚甲基哌嗪2，5二酮。
化合物V 分子式C15H20N2O2，1HNMR(DMSO)δH8.09，4.16(1H，m)8.05，3.46(1H，m)，3.14(1H，dd，3.7，13.4)，2.84(1H，dd，4.9，13.4)，0.13(1H，m)，0.76(1H，m)，7.23(1H，t，7.6)，0.60(6H，s)，7.28(2H，dd，7.6，7.9)，7.13(2H，d，7.9)，7.41(2H，d，7.6)，1.41(1H，m)，以上数据与文献报道一致［5］，确定化合物结构为3苄基6异丁基哌嗪2，5二酮。
化合物VI 分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δH7.29(1H，t，7.3)，9.90，3.95(1H，m)，6.68(1H，s)，1.60(2H，m)，1.82(1H，m)，0.88(6H，s)，7.48(2H，d，7.3)，7.40(2H，dd，7.3，7.3)，8.60，以上数据与文献一致［5］，确定化合物苯亚甲基6异丁基哌嗪2，5二酮。
2.2 化合物III、IV体外对K562细胞的抑制作用
化合物分别以DMSO溶解后，加入K562细胞培养体系中，终浓度分别为20、10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml的溶液，其中化合物IV对K562细胞表现出明显的抑制活性，化合物III也有较弱抑制活性，其他化合物未见抑制作用，结果见Fig.1。
3 讨论
我室通过筛选发现Streptomyces sp.3423号代谢产物对K562细胞有明显抑制活性。经过分离纯化得到6个化合物，并进行结构鉴定，结果显示其中2个化合物对K562细胞具有抑制活性。
Kanzaki等［3］报道，加入底物pheleu，通过生物转化过程，先后得到一次脱氢产物2，6，最后得到化合物IV。目前还未见以上6个化合物从同一菌种的天然产物分离得到。文献报道化合物Ⅰ有抑制细胞分裂的活性［2］，Fukushima等报道，在小鼠皮下移植肿瘤细胞24h后，腹腔注射不同剂量的化合物Ⅳ，以14d后测定肿瘤的大小为指标。实验结果表明，化合物Ⅳ对肿瘤抑制率为30%～50%，且毒性较低［6］。但未见对K562细胞有抑制作用的报道。
【参考文献】
［1］ 胡艳红，张庆林，曹菊荣，等. 体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物［J］. 军事医学科学院院刊，2004，28(3)：252
［2］ Kobayashi A, Ooe K, Kawazu K, et al. A new γdihydropropyrone from Streptomyces sp. as a microtubule association inhibitor toward pronuclear fusion in sea urchin eggs ［J］. Agric and Biol Chem,1989,53(3):889
［3］ Kanzaki H, Yanagisawa S, Nitoda T, et al. Biosynthetic intermediates of the tetradehydro cyclic dipeptide albonoursin produced by Streptomyces albulus KO23 ［J］. Antibiot,2000,53(11):1257
［4］ Gurney K A, Mantle P G. Biosynthesis of 1Nmethylalbonoursin by an endophytic Streptomyces sp. isolated from perennial ryegrass ［J］. J Nat Prod,1993,56(7):1194
［5］ 陈文君，吴建波，金启光，等. 农用抗生素11371个组份的分离纯化和鉴别［J］. 中国抗生素杂志，1990，15(1)：42
［6］ Fukushima K, Yazawa K, Arai T, et al. Biological activitiies of albonoursin ［J］. J Antibiot,1973,26(3):175田永强 林玲 刘浩 吴创鸿
【关键词】 土壤放线菌 环二肽 抗肿瘤活
本实验室建立了K562细胞和对格列卫耐药的K562细胞体外筛选模型［1］，通过筛选1000株土壤微生物发酵液，发现其中十余株放线菌的发酵液对K562细胞生长有强的抑制活性。选取其中一株放线菌3423，对其进行扩大发酵，并对代谢物进行提取、分离纯化、结构鉴定及活性研究。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
色谱包括分析型液相色谱仪(大连依利特公司)，Kromasil色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，配备UV230+型UVVIS检测器，制备型高效液相色谱仪(大连依利特公司)Spherisorb色谱柱(10mm×250mm，10μm)；核磁共振谱(Varian，Inova 600x型核磁共振仪)；质谱(Micromass Zabspec型质谱仪)；制备薄层(HSGF254烟台化工研究院)；反相硅胶ODS(J.BAKER)；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产；所用试剂为分析纯。
实验菌株是分离自我国江苏地区土壤的放线菌，分离保存方法见文献［1］，本实验选择菌株代号为3423。
1.2 发酵
首先将菌种涂布于平面培养基［成分(%)：可溶性淀粉1，葡萄糖2，牛肉膏0.1，酵母提取物0.4，NaCl0.2，K2HPO4 0.025，CaCO3 0.2，琼脂1，pH=7.2］上，30℃培养6d，挑取多个单克隆菌落接种于种子培养基(成分同平面培养基)上，30℃培养48h，显微镜下观察菌体形态，选择较好的一株作为菌种接种于发酵培养基(成分同种子培养基)，于摇瓶中振荡培养(250ml/500ml)，30℃培养72h。发酵终点pH为6.8左右。
1.3 提取
发酵液经离心得到菌丝体和上清液，菌丝体经丙酮浸泡12h、过滤、减压浓缩至无丙酮，乙酸乙酯提取三次；上清液加入AB8大孔吸附树脂，搅拌吸附8h，过滤，AB8用丙酮解吸附，减压浓缩至无丙酮，加等体积乙酸乙酯提取两次；合并菌丝体及发酵液的乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠干燥、过滤和减压浓缩至褐色浸膏(2g)。
1.4 分离与纯化
初提物(1.8g)采用C18反相色谱分离，以55%甲醇洗脱，收集流份以TLC分析结果进行合并，得到11个组分(A1～A11)。A1(119mg)再经过硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化(氯仿∶甲醇=40∶1)，得到化合物I；A4(414mg)经过硅胶柱层析分离，采用反相HPLC制备色谱纯化(60%甲醇)，得到化合物II；A7(193mg)经过制备HPLC得到化合物III(18mg)； A9经过制备薄层色谱和凝胶过滤得到化合物IV；A10(75.9mg)经过正相制备薄层层析(氯仿∶甲醇=100∶0.7)得到化合物V(8mg)和B10两个组分，B10再经过反相HPLC制备色谱纯化(55%甲醇)得到化合物VI(8.8mg)。
1.5 活性测定
将各化合物配制成不同浓度的溶液，加入K562细胞中。K562细胞系用含10%小牛血清PRMI1640培养液，37℃，通入5% CO2的培养箱中培育72h，加入20μl MTT溶液，继续孵育4h，吸去细胞悬液，加入120μl DMSO溶解沉淀物，酶标仪490nm下测定其光密度值。
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
化合物I 分子式C7H10O4，1HNMR(CDCl3)δH4.5(1H，dd，10.8Hz，6.6Hz)，4.3(1H，dd，13.8Hz，6Hz)，3.9(1H，dd，13.8Hz，10.8Hz)，3.7(3H，s)，2.1(3H，s)，数据与文献报道一致［2］，经鉴定为6甲基3羟基5甲氧基2.3二氢吡喃4酮。
化合物II 分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δH8.2(1H，s)，9.7(1H，s)，7.22(2H，d，7.2Hz)，7.2(2H，dd，8.2Hz，7.0Hz)，7.11(2H，d，8.2Hz)，5.25(1H，d，10.4Hz)，4.29(1H，dd，4.0Hz，4.9Hz)，3.11(1H，dd，4.0Hz，13.7Hz)，2.89(1H，dd，4.9，13.7)，2.6(1H，dqq，6.4Hz，10.4Hz)，0.83(3H，d，6.4Hz)，0.7(3H，d，6.4Hz)。数据与文献一致［3］，鉴定为3苄基6亚异丁基哌嗪2，5二酮。
化合物III 分子式C16H18N2O2，1HNMR(CDCl3)δH8.01(1H，s)，7.43(2H，t，7.2Hz，7.8Hz)，7.38(2H，d，7.8Hz)，7.33(1H，t，7.2Hz，7.8Hz)，6.98(1H，s)，5.48(1H，d，9.6Hz)，3.28(3H，s)，1.08(6H，d，6.6Hz)，以上数据与文献一致［4］，鉴定为6亚异丁基3苯亚甲基1N甲基哌嗪2，5二酮。
化合物IV 分子式C15H16N2O2，1HNMR(DMSO)δH10.34(1H，s)，9.96(1H，s)，7.50(2H，d，7.6Hz)，7.40(2H，d，7.6Hz)，7.31(1H，t，7.6Hz)，6.74(1H，S)，5.70(1H，d，10.4Hz)，2.97(1H，m，6.7Hz，10.4Hz)，0.97(6H，d，10.4Hz)。数据与相关文献对照［5］，确定化合物的结构为6亚异丁基3苯亚甲基哌嗪2，5二酮。
化合物V 分子式C15H20N2O2，1HNMR(DMSO)δH8.09，4.16(1H，m)8.05，3.46(1H，m)，3.14(1H，dd，3.7，13.4)，2.84(1H，dd，4.9，13.4)，0.13(1H，m)，0.76(1H，m)，7.23(1H，t，7.6)，0.60(6H，s)，7.28(2H，dd，7.6，7.9)，7.13(2H，d，7.9)，7.41(2H，d，7.6)，1.41(1H，m)，以上数据与文献报道一致［5］，确定化合物结构为3苄基6异丁基哌嗪2，5二酮。
化合物VI 分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δH7.29(1H，t，7.3)，9.90，3.95(1H，m)，6.68(1H，s)，1.60(2H，m)，1.82(1H，m)，0.88(6H，s)，7.48(2H，d，7.3)，7.40(2H，dd，7.3，7.3)，8.60，以上数据与文献一致［5］，确定化合物苯亚甲基6异丁基哌嗪2，5二酮。
2.2 化合物III、IV体外对K562细胞的抑制作用
化合物分别以DMSO溶解后，加入K562细胞培养体系中，终浓度分别为20、10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml的溶液，其中化合物IV对K562细胞表现出明显的抑制活性，化合物III也有较弱抑制活性，其他化合物未见抑制作用，结果见Fig.1。
3 讨论
我室通过筛选发现Streptomyces sp.3423号代谢产物对K562细胞有明显抑制活性。经过分离纯化得到6个化合物，并进行结构鉴定，结果显示其中2个化合物对K562细胞具有抑制活性。
Kanzaki等［3］报道，加入底物pheleu，通过生物转化过程，先后得到一次脱氢产物2，6，最后得到化合物IV。目前还未见以上6个化合物从同一菌种的天然产物分离得到。文献报道化合物Ⅰ有抑制细胞分裂的活性［2］，Fukushima等报道，在小鼠皮下移植肿瘤细胞24h后，腹腔注射不同剂量的化合物Ⅳ，以14d后测定肿瘤的大小为指标。实验结果表明，化合物Ⅳ对肿瘤抑制率为30%～50%，且毒性较低［6］。但未见对K562细胞有抑制作用的报道。
【参考文献】
［1］ 胡艳红，张庆林，曹菊荣，等. 体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物［J］. 军事医学科学院院刊，2004，28(3)：252
［2］ Kobayashi A, Ooe K, Kawazu K, et al. A new γdihydropropyrone from Streptomyces sp. as a microtubule association inhibitor toward pronuclear fusion in sea urchin eggs ［J］. Agric and Biol Chem,1989,53(3):889
［3］ Kanzaki H, Yanagisawa S, Nitoda T, et al. Biosynthetic intermediates of the tetradehydro cyclic dipeptide albonoursin produced by Streptomyces albulus KO23 ［J］. Antibiot,2000,53(11):1257
［4］ Gurney K A, Mantle P G. Biosynthesis of 1Nmethylalbonoursin by an endophytic Streptomyces sp. isolated from perennial ryegrass ［J］. J Nat Prod,1993,56(7):1194
［5］ 陈文君，吴建波，金启光，等. 农用抗生素11371个组份的分离纯化和鉴别［J］. 中国抗生素杂志，1990，15(1)：42
［6］ Fukushima K, Yazawa K, Arai T, et al. Biological activitiies of albonoursin ［J］. J Antibiot,1973,26(3):175田永强 林玲 刘浩 吴创鸿
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