临床医学研究中纳米盘技术的巨大潜力,SCI医学论文

　　摘    要：　膜蛋白功能广泛，参与多种细胞活动，如细胞增殖分化、信号转导、物质运输等，近年来一直是生物医学领域研究热点之一.膜蛋白天然构象的稳定是维持其生物活性的关键因素，新型纳米材料纳米盘技术采用两亲膜支架蛋白在水相中稳定磷脂分子，进而自组装形成类似于天然磷脂双分子膜环境的盘状结构，为膜蛋白的研究提供了理想平台.与传统拟膜技术相比，纳米盘具有可溶性强、稳定性佳、尺寸可控、生物相容性高、半衰期长等优点，同时可精准设计选择性靶向，应用优势巨大.本文介绍了纳米盘技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用，并重点综述了其在临床医学领域中的研究新进展，包括纳米盘作为疏水性药物、抗肿瘤靶向治疗药物的运输载体，具有高载药率、药物可控释、靶向功能的运载能力；作为小分子蛋白的拟膜环境对目标蛋白的亲和固定性和作为高密度脂蛋白的有效补充在心血管疾病中清除胆固醇的高效性和可控性.综上，纳米盘技术能够为未来膜蛋白相关研究以及其他临床疾病的诊断与治疗提供新方法与新思路.

　　关键词：　纳米盘; 膜蛋白; 靶向治疗; 疫苗制备; 心血管疾病;

　　Abstract：　A major challenge in the research on membrane protein is to deal with the absence of the lipid bilayer environment, which requires a mimic “native-like” lipid bilayer. Nanodisc, using amphiphilic membrane scaffold proteins (MSPs) to stabilize phospholipid molecules in the aqueous phase, self-assembly forms a disc-like structure similar to the natural phospholipid bilayer membrane environment. As a cutting-edge technique, nanodiscs are reported to provide model membrane environment of water solubility, homogeneity, control of oligomerization state and size, composition and specific functional modification on nanometer scale as well. In this review, we introduced the reconstitution of MSPs and integral proteins to introduce nanodiscs, followed by the nanodiscs applications in structural, functional and medical fields of membrane proteins. As for its medical applications, the high efficiency of delivery capacity as a carrier of hydrophobic drugs, and the targeting specificity of antineoplastic were particularly highlighted. Nanodisc technique also help to throw a light on the structural resolution and functional characterization of membrane proteins in imaging technology. Moreover, nanodiscs are applied to cardiovascular disease to boost the efficiency and manoeuvrability of cholesterol transport. In summary, nanodisc technique provides new method and insight into membrane protein research in the future, for better diagnosis and treatment of clinical diseases.

　　Keyword：　nanodiscs; membrane protein; targeted therapy; vaccine preparation; cardiovascular diseases;

　　膜蛋白是指能够结合或整合到细胞膜或细胞器膜上的蛋白质总称，其在细胞中含量丰富，是生物膜功能的主要执行者，在细胞的增殖和分化、能量转换、信号转导及物质运输等方面具有重要功能.不同于水溶性蛋白，膜蛋白体外很难获得稳定、均匀且正确维持膜蛋白生物构象的拟膜环境，这极大地限制了天然膜蛋白的研究[1]，而纳米盘技术则有望成为解决这些问题的有力工具[2].纳米盘采用两亲性的膜支架蛋白（Membrane Scaffold Proteins, MSP）在水相中稳定磷脂分子从而形成盘状结构，这类似于天然磷脂双分子层膜环境，同时通过整合进入其中的膜蛋白,可以在近似天然膜环境状态下保持膜蛋白生物活性.该体系还具有良好的生物相容性及较长半衰期、可精准设计选择性靶向等优点[3]，从而为膜蛋白结构与功能研究提供了良好平台.

　　纳米盘技术在膜蛋白纯化领域具有广泛应用，如：研究者将细胞色素P450（CYP450）在昆虫细胞中过量表达，再将其溶解在高浓度的胆酸钠溶液后,加入MSP颗粒，通过去污剂胶束化去除胆酸钠，得到含CYP450的纳米盘，进一步通过镍离子亲和层析和分子筛等技术进行纯化,最终得到纯度高、构象天然、功能完整的目标膜蛋白[4,5].纳米盘在此纯化过程中，既能够保证目标膜蛋白始终处于脂质双分子层中，又能最大限度避免其天然活性结构与功能遭到去污剂接触的破坏.此外，还有多个课题组通过类似研究方法纯化得到了多种功能膜蛋白，如CYP3A4蛋白[6]、CYP73A5蛋白[7]、用于结构蛋白研究的细胞色素b5[8]、人体重要铁还原酶101F6 [8,9]等，这些膜蛋白经多种实验方法验证，纳米盘技术可保持其结构和功能的完整性，实验过程可靠且可复制.
 

 

　　纳米盘也可以在简单的无细胞反应中迅速组装为均质实体，在这一过程中，无需时刻关心溶液中脂质体与蛋白质的比例，也无需通过大量实验找寻一种合适的去污剂来增溶、稳定膜蛋白后再进行纯化.例如从哺乳动物细胞上提纯ERBB蛋白时，纳米盘技术能够解决在传统去污剂环境下过度依赖融合标签、去污剂增溶等问题[10,11]，纳米盘在此过程中发挥着其均质性、对低聚状态的控制优势，而这种无细胞系统降低了相关污染物出现的可能性，进一步确保了目标膜蛋白纯度[12].

　　作为一种新型纳米生物材料，纳米盘的应用范围因其自身性能特点不断拓展[13]，已经从最初的膜蛋白纯化以及膜蛋白结构研究拓展到受体配体相互作用研究，同时在生物医学临床研究领域也表现出巨大的潜力.纳米盘作为药物载体，可有效溶解水溶性差的药物，并且能够装载一些低生物利用度药物，有力推动药物诊断与治疗学研究的迅猛发展.此外，纳米盘在心血管疾病治疗、联合化疗免疫疗法的肿瘤治疗、疫苗制备等方面亦做出重要贡献.本文将基于近年纳米盘技术研究现状，对其在膜蛋白结构与功能研究及临床医学中的应用进行重点梳理与综述.

　　1 、纳米盘——一种新型拟膜技术

　　纳米盘是一种由磷脂和MSP颗粒自组装而成的盘状磷脂双分子层，其中的MSP颗粒是一种类似ApoA-1蛋白的人工膜支架蛋白. ApoA-1是人体中高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein, HDL）的重要组成部分，在逆向胆固醇转运（Reverse Chlesterol Transport, RCT）过程中发挥着重要作用. ApoA-1由243个氨基酸残基组成，将其N端的43个氨基酸残基切掉后可形成一种柔软而具有韧性的MSP颗粒，能够用来制备纳米盘[14].制备纳米盘最常见的方式是通过适当摩尔比，将MSP颗粒添加至去污剂稳定的磷脂当中，然后选择合适的方法去除去污剂，最终MSP颗粒会禁锢脂质体而形成一个盘状复合体，即纳米盘.其中，应用最多的两种MSP颗粒分别是MSP1D1和MSP1EE3D1.通过这种方法制备的纳米盘能够在纯化膜蛋白时最大限度地保持其天然构象，以便于进一步研究[15].

　　当纳米盘技术与膜蛋白的纯化过程结合时，主要有两种方式（如图一）.其一，首先利用去污剂或其他传统手段将膜蛋白提纯，得到纯净单一的目标膜蛋白，然后将目标蛋白与MSP颗粒以适量的摩尔比混合，加入脂质，让目标膜蛋白自聚，从而实现膜蛋白在纳米盘这种拟膜环境上表达；其二，直接将MSP颗粒引入膜蛋白混合物中，同时加入过量脂质，取得多种纳米盘结构，其中有表达目标膜蛋白的，也有干扰目标膜蛋白表达的，最后将不同纳米盘分类纯化，从而实现仅留下目标膜蛋白表达纳米盘的纯化目的[16].

　　图一 利用纳米盘纯化膜蛋白的两种途径

　　Fig. 1 Two different purification methods of target membrane protein by nanodiscs

　　利用纳米盘纯化膜蛋白，首先将细胞膜上膜蛋白溶解得到膜蛋白混合物，后可选用：（方法一）1纯化膜蛋白混合物，得到目标膜蛋白纯净物后，将目标膜蛋白整合嵌入纳米盘中，得到含目标膜蛋白的纳米盘；或（方法二）2先将磷脂分子和MSP颗粒加入膜蛋白混合物中，使多种膜蛋白自组装成纳米盘混合物，而后将此含有多种膜蛋白的纳米盘进行纯化而得到含有目标膜蛋白的纳米盘.

　　纯化过程中纳米盘的大小还可以通过改变MSP颗粒的序列进行精准控制，Denisov等人[17]尝试用长短不一的MSP颗粒进行纳米盘的组装，并通过小角X射线散射（Small Angle X-ray Scattering）数据拟合到圆柱模型来测量纳米盘的尺寸，研究发现，从MSP1序列（直径为9.8 nm的纳米盘）开始，作者分别插入一个（MSP1E1）、两个（E2）、三个（E3）22-mer的MSP颗粒，可以得到直径分别为10.6 nm、11.9 nm和12.9 nm的纳米盘.

　　综上，纳米盘利用其自身的均一性和低聚性，通过人工MSP颗粒与目标膜蛋白融合而发生自聚从而实现目标膜蛋白的纯化.这一方法可以通过溶液中过量的脂质和蛋白实现，能够大大减少膜蛋白纯化的步骤，降低其纯化难度，在未来膜蛋白的研究中大有可期；同时由于其双分子层呈现出的天然性，其制备的膜蛋白在结构上更加完整、不易受到去污剂的影响和破坏，膜蛋白的功能也更加接近天然构象下的状态.

　　2、 纳米盘技术——膜蛋白功能研究的理想平台

　　膜蛋白不仅可作为细胞膜的支架结构，也在信号转导、物质运输等细胞进程中起到关键作用[18,19].但由于其自身具有双亲性质，难以直接纯化，在过度表达的过程中容易产生细胞内毒性、蛋白错误折叠、膜表面蛋白聚集等问题，这些都极大地限制了天然膜蛋白的研究[1]，而纳米盘技术则有望成为解决这些问题的有力工具之一.

　　七跨膜螺旋G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）家族广泛介导细胞内外信号转导[20]，参与嗅觉、味觉[21]和光线的感知，一直是功能膜蛋白研究热点. Leitz[22]等人利用十二烷基j3-D-麦芽糖苷将在HEK293细胞中表达的GPCRs家族蛋白j3?AR溶解，并混合添加MSP1和胆酸盐溶解的POPC，随后去除去污剂得到j3?AR纳米盘和过量的纳米盘，然后通过j3?AR蛋白C端的亲和标签将含有j3?AR的纳米盘从游离纳米盘中分离，得到高纯度目标蛋白j3?AR.通过该方法得到的j3?AR保留了其结合激动剂和拮抗剂的能力，激动剂结合j3?AR单体时引入了鸟嘌呤的快速交换，与缺少G蛋白耦连时相比，G蛋白直接诱导单体与高亲和力配体结合，证明在激动剂结合后观察到的协同作用是G蛋白与受体单体的结合而非受体自身的寡聚[23].

　　霍乱毒素（Cholera Toxin）通过与体内神经节苷脂GM1的结合介导A-亚基向细胞质的运输，干扰G蛋白信号传导并导致离子通道开放从而导致人体失水，同时有研究表明GM1头部可以诱导其发生寡聚，从而影响其与霍乱毒素的亲和力活性[24]. Borch等人通过调节每个纳米盘上结合的神经节苷脂的数量来限制其低聚，并经表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance）分析发现每个纳米盘中神经节苷脂的数量与最大霍乱毒素B亚单位的直接结合存在线性关系.这验证了神经节苷脂即使在低掺入率下也可以在较长的距离中自由扩散并自聚.但研究发现，该结合过程的动力学和亲和力参数会随着纳米盘中插入的神经节苷脂数量变化而变化，尤其是当神经节苷脂数量增加时，解离率有所降低，研究推测此结果与霍乱毒素B亚基的多价结合有关[25].随着CYPs蛋白利用纳米盘表达纯化技术的日渐成熟，其与不同配体结合过程中的协同结合特性、功能特性以及膜效应所产生影响的相关研究也得以开展.研究显示，睾酮分子与嵌入在纳米盘中的受体CYP3A4结合后，能够显着提高同类配体在另一个结合点上的亲和性，与传统模拟膜技术结果相比，受体嵌入纳米盘后与配体睾酮结合具有更强的同质协同结合性.为了进一步探究这一特性，实验将CYP3A4与它的电子供体（Cytochrome P450 Reductase, CPR）一起整合到纳米盘中，用以提供固定大小的催化活性单位，同时采用平衡底物滴定法和进行NADPH消耗的稳态动力学测量两种方法进行实验，结果显示嵌入纳米盘的CYP3A4与单个睾酮分子及不同数目的睾酮分子复合物结合后具有显着功能差异[26].在探究纳米盘膜效应对配体与受体结合过程影响的研究中，结果表明嵌入纳米盘中的CYP3A4和溶液中未结合的CYP3A4相比，其与各种配体亲和度的测量值均有显着升高[4].

　　膜蛋白纳米盘在不同环境下表现不同功能的特性在一项关于血凝块活化的临床研究中得到了很好的应用[27].正常止血过程以及许多危及生命的血栓性疾病中，凝血机制都是由血浆丝氨酸蛋白酶与组织因子整合膜蛋白[28]结合生成复合物后引发，该复合物活性受其所在膜环境的强烈影响.实验中将该复合物整合进入不同脂质构成的纳米盘后观察其在不同环境下的蛋白水解活性，结果显示在高浓度的阴离子磷脂中该复合物的活性最高，这项研究对临床利用该复合物进行凝血治疗有重要指导意义.

　　然而值得注意的是，当某些膜蛋白需要在膜两侧不同环境中进行功能重组时，使用纳米盘模拟这种膜内外的环境差异仍是难以实现的，这时纳米盘则不再适宜作为拟膜环境对该目标膜蛋白及其配体结合过程进行研究.此外，纳米盘大多采用ApoA-1衍生直径为10-15 nm的MSP颗粒，而这一范围也限制了对跨膜片段较少的膜蛋白受体及其配体结合过程的探究[29].

　　3 、纳米盘技术在临床医学研究中的巨大潜力

　　3.1、 药物载体

　　药物递送系统是采用多学科手段将药物有效地递送到目标部位，通过调节药物的代谢动力学、药效、毒性、免疫原性和生物识别等特性，使药物的治疗效应最大化的手段之一.目前临床上已经投入使用的药物递送系统有长效缓释微球、口服缓控释制剂和干粉吸入制剂等，其中最有应用前景之一的则是基于纳米盘作为药物载体的递送系统. Counsell等人早在1982年就提出脂蛋白有作为药物传递工具的潜能，但碍于当时的技术发展水平，这一研究没有继续[30,31].直到1993年Schouten等人开拓了HDL作为药物载体的新领域[32]，而现今随着纳米盘技术研究的深入，更是推动了这一领域的新进展.

　　3.1.1、 疏水性药物载体

　　据统计，目前新发现的药物中约40％的化学药物都是脂溶性药物，由于其较低的水溶性大大限制了其在生物学方面的研究进展.在实际应用中，尤其是静脉注射给药过程中常需要加入增溶剂提高其利用率，然而这种处理方式很容易导致注射剂量大以及产生毒副作用的问题，比如注射用紫杉醇在静脉注射体内后由于聚氧乙烯蓖麻油的使用易产生过敏性休克等副反应.因此寻求一种安全有效的疏水药物载体以提高脂溶性药物的利用率是亟待解决的问题.

　　纳米盘由于其模拟生物膜磷脂双分子层结构，磷脂分子的亲水头部暴露在外侧，亲脂长链位于纳米盘结构的内部，装载的药物被包裹在内部亲脂长链中间，目前有大量实验证明纳米盘材料对亲脂性的药物具有较好的负载能力.研究表明，将广为使用的疏水性化疗药物阿霉素（Doxorubicin）加入纳米盘中进行给药可引发癌细胞的免疫原性，诱导癌细胞死亡以发挥其抗肿瘤作用[33]，且过程中无明显的脱靶副作用，这种给药方式增强了CT26模型小鼠的免疫检查点阻断.此外，携带阿霉素的纳米盘进入体内可引起强大的抗肿瘤CD8+T细胞反应，同时扩大对肿瘤相关抗原、肿瘤新生抗原和完整肿瘤细胞的表位识别[34].据报道，含脂溶性药物姜黄素的纳米盘可成功应用于肝细胞瘤、套细胞淋巴瘤以及多形性成胶质细胞瘤细胞系的靶向治疗研究中；含胆固醇琥珀酸单酯（Cholesteryl Hydrogen Succinate）修饰的紫杉醇纳米盘能够有效阻止该药物在肿瘤模型小鼠体内过早释放，从而有望提高其抗肿瘤功效[35]；含ApoE3的纳米盘能有效减少SAMP8模型小鼠体内β淀粉样蛋白的沉积，减少小胶质细胞的增生，改善其神经功能变化，从而挽救SAMP8模型小鼠的记忆缺陷[36].

　　纳米盘作为药物载体除可以有效溶解一些水溶性差的药物之外，研究还发现其装载的药物有较高的利用率及安全性，如抗真菌化合物两性霉素B.采用纳米盘载体结合该药物后发现其在体内外均表现出强大的抗真菌活性，且在治疗剂量下未观察到毒性，为抗真菌治疗研究做出贡献.此外，随着纳米盘在药物载体方面的应用不断拓展，目前已广泛用于装载低生物利用度药物，以治疗肿瘤[37]、阿尔茨海默症[38]等疾病，均在动物实验阶段有良好的结果反馈.

　　3.1.2 、肿瘤靶向药物载体

　　目前在肿瘤疾病治疗过程中化学疗法的应用已取得了巨大进展，但由于某些肿瘤易产生非特异性毒性，其疗效仍未达到最理想效果.最近有研究提出，以癌细胞中过度表达的膜受体为靶点，设计靶向给药系统，利用纳米颗粒进行药物载体化治疗，是保证选择性有效载荷传递，从而提高治疗效果的有效方法[39]，这一思路为解决化学疗法过程中基本的临床问题提供了可能性.

　　作为研究热点之一的纳米递药系统构建的药物制剂尺寸小，粒径分布窄，表面修饰后可以进行靶向特异性定位，达到药物靶向输送的目的，并且还能保护药物分子，提高稳定性与生物相容性，可将显像和治疗相结合，实现疾病的诊断和治疗.基于这些优点，越来越多的研究者开始关注利用纳米载体用于药物输送的研究，以克服肿瘤治疗中的困难.

　　最近的研究表明，Padma Kadiyala等人[40]通过在32-34只小鼠纹状体内植入GL26-cit肿瘤，构建GL26同基因小鼠胶质瘤模型，以模拟人类多形性成胶质细胞瘤中的组织病理学特征.植入后第7天在肿瘤内注射经DiD荧光示踪剂标记后的载药纳米盘，注射后24小时进行灌流，并对大脑进行共焦成像处理，实验结果分析表明荧光示踪剂信号与肿瘤微环境密切相关.为了进一步评估载药纳米盘在体内的生物分布，研究者将GL26-wt细胞植入C57BL6小鼠模型一侧大脑半球的纹状体内，注射后21天时对荷瘤和非肿瘤小鼠模型再注射经DiR荧光示踪剂标记后的载药纳米盘，于注射后24小时灌流小鼠，利用体内光学成像系统（In Vivo Optical Imaging）观察心脏、胸腺、肺、脾、肝、脑、肾等器官的荧光强度，结果显示DiR荧光示踪剂信号具有很强的肿瘤特异性，荷瘤动物的肿瘤侧大脑半球可观察到较强的荧光示踪剂信号，在荷瘤动物的肿瘤对侧半球或非肿瘤小鼠大脑中都没有观察到荧光信号，且肝脏、胸腺、心脏、肺、肾脏和脾脏中的荧光信号均不明显，这表明通过纳米盘作为载体的运输途径在治疗多形性成胶质细胞瘤时可以到达并留在大脑内的靶组织中，而不会在非靶器官系统中积聚，从而可以提高其体内靶向效率，显示了纳米盘作为多形性成胶质细胞瘤治疗运载平台的应用潜力.

　　除此以外，纳米盘给药技术在疫苗制备过程中也表现出其良好的靶向应用潜力.肿瘤疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，配合其他免疫刺激因子诱导机体激活特异性细胞免疫和体液免疫反应，从而抑制肿瘤细胞的生长、转移和复发.长期以来，肿瘤抗原递呈的靶向性、有效性及安全性一直是肿瘤疫苗发展的重难点问题. Fang RH等[41]将寡聚核酸佐剂分子嵌入纳米盘以模拟小鼠黑色素瘤细胞膜表面，携带肿瘤细胞特异性抗原的纳米盘表面相对完整地保留了肿瘤细胞表面的组成成分和理化性质，可以有效诱导抗原提呈细胞的成熟，刺激T细胞的增殖和免疫应答，并可靶向进入淋巴结，增加纳米疫苗的血液循环时间，进而克服了肿瘤抗原表达多样化、抗原突变率高的问题.

　　迄今为止，纳米盘作为药物载体因其特殊的优越性，如药物控释、靶向功能、高载药率等，在应用研究方面已经取得了长足进展，但目前仅限在动物模型中进行相关测试，仍需进一步深入探究与验证才有望在临床使用当中更好发挥其作为药物载体的优势.

　　3.2 、成像技术

　　在临床研究中，疾病诊断和对药物作用的观察是必不可少的，而先进的成像技术能够使这一过程更加精确.然而，在现有的小分子成像技术中，常常存在因目标蛋白异常聚集、浑浊样品结晶困难而导致的观察桎梏.将纳米盘引入后，有助于实现亲和标签的固定，使目标膜蛋白即使面临高浓度聚集情况时，也能在拟膜环境中保持其天然构象、完整功能以及充分的流动性等特征.

　　X射线晶体衍射法（X-ray Diffraction）能够以原子或接近原子水平的分辨率显示生物分子的三维结构.在以往的研究中主要面临结晶困难的问题.将纳米盘引入后，观察者们可以通过设计MSP颗粒使其形成一个二维的结晶格[42]，或使用特定的抗体为脂质双分子层提供更大的空间位置以便形成晶体的接触，避免结晶困难等问题. 2020年，Jost[43]等人通过使用时间解析的小角度X射线散射法，研究了在分离的核苷酸结合区（Nucleotide-Binding Domains, NBDs）和脂质纳米盘中全长离子通道蛋白MsbA的背景下NBDs二聚化（ATP绑定时）的动力学和伴随的结构变化（ATP水解时），且研究数据能够确定NBDs二聚化形成和分离的时间常数.

　　冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy）通过对样品颗粒从不同角度拍摄最后进行叠加而得出分子结构影像，这种方法对蛋白样品的均一性有较高要求，此外蛋白样品中一些结构可变的柔性结构也会对结构测定造成较大影响.纳米盘均一性高的优势可用来分离膜蛋白以及膜蛋白复合物，同时能够避免其异常聚集且使其保持天然构象和功能，为目标膜蛋白的冷冻观测提供良好条件. Lee等人将纳米盘与人类病原体Coxsackie病毒B3（CVB3）结合时发现在双分子层表面附近的电子密度扩展现象和病毒外壳表面通道形成，取得了利用冷冻电镜方法捕获病毒侵入细胞研究的新突破[44].

　　核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）技术同样应用于高分辨率的结构生物学研究中[45]，但由于膜蛋白趋向于在膜表面发生聚集，导致了这一技术陷入研究瓶颈. 2016年，Yao等研究了BCL-2家族中一种重要抗癌药物靶点BCL-XL在单独分离和与纳米盘结合的全长状态下C端的不同，并发现BCL-XL在C端形成了跨膜α螺旋，但其本身具有流动性大、易受可溶性蛋白水解的特点[46]，这开拓了在后续抗癌药物研发中药物靶点的研究方向.

　　此外，由于纳米盘的单分散度高、分散性好，在缺少膜蛋白完整的结构测定时，纳米盘也可以用于明确该种膜蛋白在拟膜环境下的长度和方向，还可以用来定义膜蛋白在天然双层环境中的特定距离和方向[47].相关研究包括配体与麦芽糖转运蛋白MalFGK2结合引起的构象和动力学变化[48]，以及使用DEER光谱来检测纳米盘内GPCRs结合信号配体后的构象变化[49]，为研究药物与体内靶点结合提供了新的结构学、动力学依据.

　　除此之外，氧结合和自动氧化动力学在测量嵌入纳米盘中的膜蛋白单体过程中显示纯粹的指数图像，这与传统的溶液聚集体不同，能够有效避免在解释实验数据时产生的歧义，研究通过这种方法解释了CYP450人体代谢酶CYP3A4单体的功能性意义，并对膜环境对配体结合的局部影响进行了精准而严格的评估[50].使用放射性标记的纳米盘可以用来研究乳腺癌模型中相关巨噬细胞的定量正电子发射断层扫描成像技术（Positron Emission Tomography），则显示了纳米盘在无创成像领域中的巨大优势与潜力.

　　除简单的蛋白质分子与药物研究外，纳米盘还可以作为造影剂载体应用于临床诊断.心血管疾病在早期发现后需要及时识别动脉粥样硬化病变类型以区分稳定性斑块和不稳定性斑块，方便相应治疗.纳米盘颗粒因其体积小可以穿透斑块，并且已被证明可以在动脉粥样硬化中靶向进入载脂巨噬细胞，而巨噬细胞浸润程度与病变进展、斑块大小和内膜厚度呈正相关，这为病变类型的诊断提供巨大的优势. Shaish等人首次在Apo E- /-小鼠的主动脉弓粥样硬化病变中发现放射性标记的纳米盘成分，这一发现吸引了研究者的兴趣，Cormode和他的同事们继续采用HDL进行NMR增强扫描.在利用NMR的实验中，钆（Gd-）作为基础的造影剂被纳入到纳米盘中，纳米盘由富含载脂螯合物的单一脂质成分重组而成.结果显示核磁共振成像和光学成像的双探针标记纳米盘可以在体内和体外进行多模态成像[51].例如，在注射后24小时，纳米盘颗粒在Apo E- /-小鼠主动脉斑块的巨噬细胞富集部位积聚，表现出了显着增强的NMR信号.鉴于以上实验研究，未来将成像和治疗药物集成在一个纳米盘内应用于心血管及其他临床疾病研究中，能够实现早期检测、成像诊断及同时运载治疗药物这一目标[52].

　　3.3 、心血管疾病中应用

　　据世界卫生组织统计报告显示，心血管疾病目前已经成为全球的头号死因，占全球死亡总数的30%以上，是社会健康与经济的重要负担之一.而动脉粥样硬化是心血管疾病中冠心病（Coronary Heart Disease, CHD）发病和死亡的主要原因，因此全面防控患病危险因素，控制胆固醇水平成为降低冠心病死亡率的关键.

　　脂蛋白是血液中脂肪或胆固醇等脂溶性化合物的内源性载体，具有明确的结构和多种生物功能，在脂质代谢中起主导作用，因而在动脉粥样硬化病变的预防和逆转中也有巨大的研究意义. HDL颗粒是最小的一组脂蛋白颗粒，主要具有抗动脉粥样硬化的保护作用，其潜在的保护机制依赖于HDL可以在ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1）与ABCG1（ATP-binding cassette transporter G1）依赖机制下从外周组织中去除多余胆固醇[53].具体过程以充满脂质的巨噬细胞为例，ApoA-1在肝脏和肠内以无脂形式合成，通过肝细胞ABCA1转运蛋白与磷脂和胆固醇迅速脂化，形成新生盘状HDL.在外周组织中，新生的HDL颗粒通过巨噬细胞ABCA1和ABCG1转运蛋白吸收游离胆固醇，经卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（Lecithin Cholesterol Acetyltransferase, LCAT）酯化形成球形HDL3.成熟的HDL3粒子形成，可以转化为HDL2被肝脏吸收，也可能被内皮或肝脂肪酶修饰[52]（如图二），上述生理过程明确后经进一步的脂质组学和蛋白质组学研究发现，血液高密度脂蛋白水平与心血管疾病发生的风险呈负相关，这使得人们普遍接受高密度脂蛋白血清浓度有助于预防心血管疾病的理论.与这些发现相一致，许多提高循环HDL水平的治疗方法一直是药学研究的焦点.然而，很快研究者们发现仅仅增加循环中的HDL颗粒数量远远不足以显着治疗心血管疾病，还应注重提高加入循环中HDL的功能性，如HDL颗粒的大小和形态变化能力.纳米盘组成和物理化学参数可以很容易地进行化学调节和操纵，通过反复实验调整其尺寸、均匀性，使得清除胆固醇效率达到最佳状态，从而能够有效减少动物模型中动脉粥样硬化改变，并已在治疗心血管疾病的一些早期动物实验中得到验证[54].例如，在兔血管炎症模型中，每日向血管中输注嵌入二棕榈酰基-磷脂酰胆碱（Dipalmitoyl-phosphatidylcholine, DPPC）的纳米盘制剂成功地抑制了中性粒细胞浸润和粘附分子的表达，进而减少炎症和致动脉粥样硬化的过程.将磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）嵌入纳米盘对动脉粥样硬化小鼠模型进行输注，检测结果显示血浆炎症生物标记IL - 6与TNFα水平以及细胞间粘附分子水平均有降低，另一方面也反映出纳米盘与PS特异性受体的相互作用可能间接有助于PS的抗炎作用.

　　图二 循环系统高密度脂蛋白与纳米盘代谢示意图

　　Fig. 2 Schematic diagram of high density lipoprotein （HDL）and nanodisc metabolism in the circulatory system.

　　ApoA-1在肝脏和肠道中以无脂形式合成，与磷脂和胆固醇迅速脂化形成盘状新生HDL.在周围组织中，新生的HDL颗粒通过巨噬细胞ABCA1和ABCG1转运体吸收游离胆固醇.游离胆固醇经卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）酯化形成胆固醇酯.成熟的HDL3粒子形成，可以转化为HDL2，被肝脏通过SR-B1吸收.纳米盘在体外装载完毕，注射进入体内后被重塑为球状HDL，参与循环过程.

　　目前利用人体纯化后的ApoA-1及脂质成分结合的纳米盘在这一方向的应用进展已经取得了一些有代表性的研究成果（见表1），Duivenvoorden等人最近开发了负载他汀类药物的纳米盘，将辛伐他汀传递到动脉粥样硬化斑块以抑制炎症.在Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型体内观察到，由于他汀类药物纳米盘的抗炎作用，巨噬细胞的存活率降低，在一周高剂量治疗后，使用gd标记颗粒的NMR观察到炎症显着减少，而3个月低剂量治疗通过直接靶向斑块巨噬细胞能够抑制斑块炎症.在另一个例子中，Zhang等人将血管活性心脏保护药物丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA）纳入圆盘状纳米盘中注射进入动脉粥样硬化新西兰兔（New Zealand white rabbit breed）模型中，进入体内后的盘状纳米盘被酶解重塑为球形纳米盘，丹参酮IIA经纳米盘承载后能更加迅速地作用于动脉粥样硬化斑块内的泡沫细胞，表现出较强的抗动脉粥样硬化作用[53].这些结果表明使用纳米盘结合降脂药物的抗增生性治疗策略为动脉粥样硬化中的炎症打开了一个新的治疗窗口.

　　表一 纳米盘技术用于治疗心血管疾病的代表性举例

　　动物实验的良好结果促进研究人员进一步开展临床试验，目前正在进行的几项早期试验结果显示患者对纳米盘制剂有很好的耐受性，通过静脉注射可显着提高人血浆中HDL的水平，从而抑制动脉粥样硬化壁的脂肪条纹形成和脂质沉积，并减少动脉粥样硬化体积和斑块重塑的现象[61].对于稳定的动脉粥样硬化疾病患者，一次性给予适量嵌入CSL-112的纳米盘制剂可显着增加ABCA1依赖性胆固醇的代谢外排，并观察到纳米盘一旦进入循环，就会迅速重塑为成熟的球形HDL，比使用天然HDL进行输液治疗所达到的循环时间更长更具优势[62]. Cerenis Therapeutics公司的CER-001是另一个进入临床试验II期的例子，该试验将二棕榈酰基-磷脂酰甘油(Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylglycerol）组装进纳米盘并通过静脉注射进入血管内，检测结果表明虽然该制剂对胆固醇代谢外排和减轻血管炎症有良好的作用，但灌注CER-001后并没有观察到冠状动脉粥样硬化斑块体积的明显消退，对急性冠脉综合征后高斑块负荷的状况没有发挥其预期的效果.在此基础上值得思考的是，在进行纳米盘输注疗法增加体内HDL颗粒数量时，还必须对纳米盘模拟HDL结构和动力学进行更深刻的探讨与研究[63].

　　在培养的细胞和动物模型中，纳米盘已经显示出其作为诊断和治疗实体的巨大潜力，然而在临床试验开发的早期阶段，为了满足体外、体内试验的各项标准，一个主要的挑战是对其物理化学特性的精确控制，制造技术、成分、浓度、辅料、盐、pH值或温度均会影响装配过程中的性能变化.一旦建立了体外应用，另一个需要关注的难点是制剂在体内的安全治疗剂量和药物传递系统的有效性.纳米盘必须符合药物动力学的相关标准，确定获得预期效果所需的最小治疗活性剂量，以及脱靶效应导致毒性之前的最大耐受剂量，以获得有益的治疗指标.虽然纳米盘通常无毒且耐受性良好，但表面修饰或化学成分修饰可能会引发免疫反应或炎症反应，因此每一种新成分都需要进行单独的毒理学评估.这些因素的限制导致目前只有少数试验进行到早期临床阶段.

　　4 、结语

　　纳米盘作为一种人工制备的拟膜结构，为长期以来受结构不稳定、聚集不方便所影响的膜蛋白研究提供了更好的平台；其大小可调，能够适应不同尺寸目标膜蛋白的表达需求；可提供长半衰期、强稳定性、高可溶性和精准靶向的优势拟膜环境，已被广泛应用于膜蛋白的生产纯化、受体配体结合的药物靶点研究以及结构生物学等领域.这种新型拟膜结构已得到国内外研究者广泛关注与认可，已用于多种膜蛋白的深入研究，其对于脂质体和膜蛋白出色的纯化、溶解和控制作用将推动膜蛋白研究在分子化学、结构生物学领域不断深化.同时在临床医学领域[64]，纳米盘已在药物载体、疫苗制备和多种疾病的预防与治疗中展现出巨大的潜力.相信在不远的将来，纳米盘能够在生物医疗领域为我们提供更多更加新颖、更加可靠的治疗方案.

　　值得注意的是，纳米盘技术相关研究仍有待突破.首先，受限于其制备材料ApoA-1衍生直径的限制，它并不能作为跨膜片段较少膜蛋白的合适研究载体；其次，由于纳米盘两端环境的同一性，在面对需要环境差异的膜蛋白研究中有明显的局限性，这启发我们应对于适用性更强的纳米盘制备材料进行开发.而在临床应用方面，纳米盘的介入尚处于起步阶段，应加强对其疗效特殊优势的研究.因此，纳米盘技术仍需要进一步开发和改进.

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